mRNA-Tracking mit fluoreszierendem Cytosin bewahrt natürliches Verhalten
Obwohl es mehrere Methoden zur Markierung und Verfolgung von RNA in lebenden Zellen gibt, neigen sie stark zu der einen oder anderen Seite eines ärgerlichen Kompromisses. Auf der einen Seite gibt es Markierungen, die ein starkes Signal aussenden und die mRNA-Aktivität stören. Auf der anderen Seite gibt es Marker, die die natürliche mRNA-Aktivität erhalten und ein schwaches Signal aussenden. Dieses Dilemma kann durch eine neue Methode gelöst werden, die von Forschern der Chalmers University of Technology entwickelt wurde.
Mit der neuen Methode können mRNA-Transkripte erzeugt werden, die das Triphosphat von tCO, einem fluoreszierenden trizyklischen Cytosin-Analogon, enthalten. Diese Transkripte lassen sich gut visualisieren und leicht verfolgen. Außerdem verhalten sie sich genau wie gewöhnliche mRNA-Transkripte, da das fluoreszierende Cytosin dem gewöhnlichen Cytosin sehr ähnlich ist. Das fluoreszierende Cytosin, 1,3-Diaza-2-Oxophenoxazin, kann sowohl über End-Labeling-Reaktionen als auch über zellfreie Transkription enzymatisch in hoher Zahl in RNA eingebaut werden.
In einer aktuellen Studie zeigte das Chalmers-Team, dass fluoreszierende Cytosine alle natürlichen Cytosine in einer 1,2 km langen mRNA ersetzen können, die für das mit grün fluoreszierendem Protein fusionierte Histon H2B kodiert (H2B:GFP). Diese mRNA, so berichten die Forscher, behält die Translationskompetenz sowohl in vitro als auch in menschlichen Zellen. Darüber hinaus zeigten die Forscher, dass ihre markierte mRNA ausreichend fluoreszierend ist, um direkt durch konfokale Mikroskopie in einer lebenden menschlichen Zelle sichtbar gemacht zu werden. Dementsprechend schlugen die Forscher vor, dass ihre Methode zur Untersuchung von mRNA-Transport und Protein-Translation im Kontext der Medikamentenverabreichung eingesetzt werden könnte.
Die detaillierten Ergebnisse erschienen im Journal of the American Chemical Society in einem Artikel mit dem Titel „Stealth Fluorescence Labeling for Live Microscopy Imaging of mRNA Delivery.“
„Die Analyse der Transkriptionsprodukte zeigte, dass tCO praktisch genauso effizient in die RNA eingebaut wird wie natives CTP und daher in dieser Hinsicht eine echte, die Natur nachahmende fluoreszierende Modifikation darstellt“, schreiben die Autoren des Artikels. „Erstaunlicherweise fanden wir auch, dass tCO-markierte mRNA in ihr korrekt gefaltetes und lokalisiertes Proteinprodukt übersetzt wird, sowohl in vitro als auch in lebenden Zellen.“
„Wir präsentieren das erste Beispiel einer mit einem fluoreszierenden Nukleobasen-Analogon markierten Nukleinsäure, die direkt in lebenden Zellen sichtbar gemacht werden kann, und zeigen, dass die Helligkeit und Absorption von tCO bei 405 nm ausreicht, um bisherige Einschränkungen mit FBA-Sonden in biologischen Anwendungen zu überwinden“, fügten sie hinzu. „Darüber hinaus demonstrieren wir, wie dies auf bequeme Weise die räumlich-zeitliche Überwachung der Aufnahme, des Traffickings und der Organellen-Kolokalisation von chemisch transfizierter mRNA in einem Lebendzellmodell mit gleichzeitigem Nachweis ihrer Translation in H2B:GFP-Protein ermöglicht.“
Die Autoren des Artikels betonen, dass ihre Methode die Entwicklung neuer und verbesserter Verabreichungsstrategien für nukleinsäurebasierte Medikamente der nächsten Generation sowie die Weiterentwicklung der kürzlich erfolgreichen mRNA-basierten Impfstoffe erleichtern könnte.
RNA-basierte Therapeutika bieten eine Reihe neuer Möglichkeiten zur Vorbeugung, Behandlung und potenziellen Heilung von Krankheiten. Aber derzeit ist die Lieferung von RNA-Therapeutika in die Zelle ineffizient.
„Da unsere Methode helfen kann, eines der größten Probleme bei der Entdeckung und Entwicklung von Medikamenten zu lösen, sehen wir, dass diese Forschung einen Paradigmenwechsel von traditionellen Medikamenten zu RNA-basierten Therapeutika ermöglichen kann“, sagt Marcus Wilhelmsson, PhD, Professor bei Chalmers und einer der Hauptautoren des Artikels.
Eine Herausforderung bei der Arbeit mit mRNA ist, dass die Moleküle sehr groß und geladen, aber gleichzeitig zerbrechlich sind. Sie können nicht direkt in die Zellen gelangen und müssen daher verpackt werden. Die bisher erfolgreichste Methode verwendet sehr kleine Tröpfchen, so genannte Lipid-Nanopartikel, um die mRNA zu verkapseln. Es besteht noch großer Bedarf, neue und effizientere Lipid-Nanopartikel zu entwickeln – woran auch die Chalmers-Forscher arbeiten. Dazu ist es notwendig zu verstehen, wie die mRNA in die Zellen aufgenommen wird. Die Möglichkeit, in Echtzeit zu verfolgen, wie sich die Lipid-Nanopartikel und die mRNA in der Zelle verteilen, ist daher ein wichtiges Werkzeug.
„Der große Vorteil dieser Methode ist, dass wir jetzt leicht sehen können, wo in der Zelle die gelieferte mRNA hingeht und in welchen Zellen das Protein gebildet wird, ohne dass die natürliche Protein-Translationsfähigkeit der RNA verloren geht“, bemerkte Chalmers‘ Elin Esbjörner, PhD, außerordentliche Professorin und die zweite Hauptautorin des Artikels.
„Bis jetzt war es nicht möglich, die natürliche Geschwindigkeit und Effizienz zu messen, mit der RNA in der Zelle agiert“, fügte Wilhelmsson hinzu. „Das bedeutet, dass man die falschen Antworten auf die Fragen bekommt, die man stellt, wenn man versucht, ein neues Medikament zu entwickeln. Wenn Sie zum Beispiel eine Antwort darauf haben wollen, mit welcher Rate ein Prozess abläuft, und Ihre Methode gibt Ihnen eine Antwort, die ein Fünftel der richtigen ist, wird die Medikamentenentwicklung schwierig.“
Um eine sinnvolle Kommerzialisierung der Methode zu gewährleisten, haben die Forscher eine Patentanmeldung eingereicht und planen mit Unterstützung des Business-Inkubators Chalmers Ventures und des Chalmers Innovation Office ein Spin-off-Unternehmen.
„Wir glauben“, so die Autoren des Artikels, „dass die hier berichtete Entwicklung der pharmazeutischen Industrie, klinischen Laboren und akademischen Partnern, die ihr Verständnis der Aufnahme- und endosomalen Escape-Mechanismen vertiefen wollen, zugute kommen wird und es ihnen ermöglicht, wichtige Schritte in Richtung neuer und verbesserter Verabreichungsstrategien zu unternehmen.“
Quelle: https://www.genengnews.com/news/mrna-tracking-with-fluorescent-cytosine-preserves-natural-behavior/
