Das S1-Protein von SARS-CoV-2 ist gefährlich für den Menschen
Zusammenfassung
Es ist unklar, ob das schwere akute respiratorische Syndrom-Coronavirus 2, das die Coronavirus-Krankheit 2019 verursacht, in das Gehirn eindringen kann. Das schwere akute respiratorische Syndrom-Coronavirus 2 bindet an Zellen über die S1-Untereinheit seines Spike-Proteins. Wir zeigen, dass intravenös injiziertes radiojodiertes S1 (I-S1) bei männlichen Mäusen leicht die Blut-Hirn-Schranke passierte, von Hirnregionen aufgenommen wurde und in den parenchymatösen Hirnraum gelangte. I-S1 wurde auch von der Lunge, Milz, Niere und Leber aufgenommen. Intranasal verabreichtes I-S1 gelangte ebenfalls ins Gehirn, allerdings in etwa zehnmal niedrigeren Konzentrationen als nach intravenöser Verabreichung. Der APOE-Genotyp und das Geschlecht beeinflussten die I-S1-Aufnahme im gesamten Gehirn nicht, hatten aber variable Auswirkungen auf die Aufnahme im Riechkolben, in der Leber, der Milz und der Niere. Die I-S1-Aufnahme im Hippocampus und im Bulbus olfactorius wurde durch Lipopolysaccharid-induzierte Entzündungen reduziert. Mechanistische Studien zeigten, dass I-S1 die Blut-Hirn-Schranke durch adsorptive Transzytose überwindet und dass das murine Angiotensin-konvertierende Enzym 2 an der Aufnahme im Gehirn und in der Lunge, aber nicht an der Aufnahme in Niere, Leber oder Milz beteiligt ist.
Hauptteil
Das Coronavirus 2 des Schweren Akuten Respiratorischen Syndroms (SARS-CoV-2) ist verantwortlich für die Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). Neben Lungenentzündung und akuter Atemnot ist COVID-19 mit einer Reihe von Symptomen verbunden, die das ZNS betreffen, darunter Geschmacks- und Geruchsverlust, Kopfschmerzen, Zuckungen, Krampfanfälle, Verwirrung, Sehstörungen, Nervenschmerzen, Schwindel, Bewusstseinsstörungen, Übelkeit und Erbrechen, Halbseitenlähmung, Ataxie, Schlaganfall und Hirnblutungen. Es wurde postuliert, dass einige der Symptome von COVID-19 auf direkte Einwirkungen des Virus auf das ZNS zurückzuführen sein könnten; so könnten z. B. respiratorische Symptome zum Teil darauf zurückzuführen sein, dass SARS-CoV-2 in die respiratorischen Zentren des Gehirns eindringt. Enzephalitis wurde auch bei COVID-19 berichtet und könnte eine Folge des Eindringens von Viren oder viralen Proteinen in das Gehirn sein. SARS-CoV-2 mRNA wurde aus der Zerebrospinalflüssigkeit gewonnen, was darauf hindeutet, dass es die Blut-Hirn-Schranke (BHS) überwinden kann. Andere Coronaviren, einschließlich des eng verwandten SARS-Virus, das den Ausbruch 2003-2004 verursachte, sind in der Lage, die BHS zu überwinden, und SARS-CoV-2 kann Neuronen in einem BrainSphere-Modell infizieren. SARS-CoV-2 könnte jedoch Veränderungen im ZNS induzieren, ohne die BHS direkt zu überwinden, da COVID-19 mit einem Zytokinsturm assoziiert ist und viele Zytokine die BHS überwinden, um die ZNS-Funktion zu beeinflussen.
Hier untersuchen wir, ob ein virales Protein von SARS-CoV-2, das Spike-1-Protein (S1), die BHS passieren kann. Erstens wurde gezeigt, dass einige Proteine, die von Viren ausgeschieden werden, die BHS überwinden, eine Neuroinflammation induzieren und anderweitig die Funktionen des ZNS beeinträchtigen. Zweitens kann das virale Protein, das an Zellen bindet, als Modell für die Aktivität des Virus verwendet werden; mit anderen Worten, wenn das virale Bindungsprotein die BHS überwindet, ist es wahrscheinlich, dass dieses Protein das Virus befähigt, die BHS ebenfalls zu überwinden. S1 ist das Bindungsprotein für SARS-CoV-2; es bindet an Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)21,22,23 und wahrscheinlich auch an andere Proteine.
In dieser Studie zeigen wir, dass I-S1 leicht die murine BHS überquerte, in das parenchymale Gewebe des Gehirns eintrat und in geringerem Maße von Endothelzellen des Gehirns sequestriert und mit der Glykokalyx der Hirnkapillare assoziiert wurde. Wir beschreiben die Eintrittsrate von I-S1 in das Gehirn nach intravenöser (i.v.) und intranasaler Verabreichung, bestimmen seine Aufnahme in 11 verschiedenen Hirnregionen, untersuchen den Einfluss von Entzündung, APOE-Genotyp und Geschlecht auf den I-S1-Transport und vergleichen die I-S1-Aufnahme im Gehirn mit der Aufnahme in Leber, Niere, Milz und Lunge. Basierend auf Experimenten mit dem Glykoprotein WGA fanden wir heraus, dass der Eintritt von I-S1 ins Gehirn wahrscheinlich über den vesikulär-abhängigen Mechanismus der adsorptiven Transzytose erfolgt.
Ergebnisse
I-S1-Protein wird über die Blut-Hirn-Schranke der Maus transportiert
Wir erhielten S1-Proteine aus zwei kommerziellen Quellen: RayBiotech und AMSBIO. Die S1-Proteine wurden intern radiomarkiert und nach der Markierung durch Autoradiographie-Gele als intakt verifiziert. Wir untersuchten, ob intravenös injiziertes I-S1 die BHS in Mäusen überwinden kann, indem wir seine Blut-Hirn-Einstromkonstante (Ki) mit Hilfe der Multiple-Time Regression Analysis (MTRA) maßen. Die MTRA stellt die Gewebe/Serum-Verhältnisse für I-S1 gegen die Expositionszeit dar, die ein Zeitmaß ist, das um die Clearance von I-S1 aus dem Blut korrigiert wurde. Die Steigung des linearen Teils dieses Diagramms misst Ki, d. h. die unidirektionale Einstromkonstante für I-S1.
Wir haben 99mTc-markiertes Albumin (T-Alb) zusammen mit dem I-S1 injiziert. T-Alb durchquert die intakte BHS schlecht und kann daher zur Messung des vaskulären Raums des Gehirns verwendet werden. Jedes Hirn/Serum-Verhältnis für I-S1, das das Hirn/Serum-Verhältnis von T-Alb übersteigt, repräsentiert daher extravaskuläres I-S1, d. h. Material, das die BHS passiert hat. T-Alb kann auch zur Messung der Leckage von peripheren Gewebebetten und einer durch Krankheit oder Entzündung gestörten BHS verwendet werden.
Die Ki-Werte der I-SI-Proteine aus den beiden Quellen unterschieden sich um etwa 3 %. Diese Ergebnisse zeigen, dass I-S1 im Gegensatz zu T-Alb die BHS der Maus leicht überwinden kann.
I-S1 wird aus dem Blut ausgeschieden und von peripheren Geweben aufgenommen
Wir bestimmten die Clearance von intravenös injiziertem I-S1 von RayBiotech aus dem Blut und seine Aufnahme im Gehirn und anderen Geweben, wiederum mit MTRA. Die Clearance von I-S1 aus dem Blut war in den ersten 10 min linear, mit einer Halbwertszeit der Clearance von etwa 6,6 min, gefolgt von einem Plateau. Diese „Delta“-Gewebe/Serum-Verhältnisse wurden somit um das I-S1 im Gefäßraum und um jegliches I-S1 korrigiert, das aufgrund eines undichten Kapillarbettes in das Gewebe gelangt wäre. Die resultierenden Delta-Werte stellen somit die spezifische Aufnahme von I-S1 durch die Gewebe dar.
Alle Gewebe zeigten eine Aufnahme von I-S1. Die Aufnahme in Milz und Leber war nichtlinear, was darauf hindeutet, dass ihre Gewebebetten mit dem Blut in ein Gleichgewicht kommen. Die meisten Substanzen im Blut werden über die Niere oder die Leber abgebaut; die viel höhere I-S1-Aufnahme in der Leber im Vergleich zur Niere deutet darauf hin, dass I-S1 vorwiegend über die Leber aus dem Blut abgebaut wird. Um festzustellen, ob es regionale Unterschiede in der I-S1-Aufnahme innerhalb des Gehirns gibt, haben wir den Riechkolben entnommen und das gesamte Gehirn in zehn Regionen seziert. Wir fanden heraus, dass I-S1 in alle Hirnregionen aufgenommen wurde, wobei es keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Regionen gab.
Auf ähnliche Weise bestimmten wir die Clearance von I-S1 (AMSBIO) aus dem Blut und seine Aufnahme in das Gehirn und andere Gewebe. Die Ergebnisse waren ähnlich denen, die mit dem von RayBiotech abgeleiteten I-S1 erzielt wurden, aber es gab ein paar Unterschiede. Das von AMSBIO stammende I-S1 wurde schneller aus dem Blut abgebaut (Halbwertszeit von 3,6 min), und die Rate der Leberaufnahme war fast fünfmal schneller als die Leberaufnahme des von RayBiotech stammenden I-S1 (P < 0,0001). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass I-S1 primär durch die Leber aus dem Blut abgebaut wird und dass S1 Zugang zu anderen für COVID-19 relevanten Geweben hat, einschließlich Niere, Lunge und Milz.
I-S1 ist stabil in Gehirn und Blut
Wir maßen die Stabilität von intravenös injiziertem I-S1 von RayBiotech in Blut und Gehirn durch Säurefällung. I-S1, das ex vivo zu Geweben (Verarbeitungskontrollen) gegeben wurde, zeigte wenig Abbau. Die Radioaktivität, die aus dem Gehirn 10 min nach i.v.-Injektion und aus dem Serum 10 und 30 min nach i.v.-Injektion von I-S1 wiedergewonnen wurde, war stabil, wobei der größte Teil der Radioaktivität durch Säure ausgefällt wurde. Die Radioaktivität, die 30 Minuten nach der i.v.-Injektion von I-S1 aus dem Gehirn gewonnen wurde, war größtenteils abgebaut. Dies deutet darauf hin, dass I-S1 intakt in die BHS eintritt, aber schließlich im Gehirn abgebaut wird, obwohl nicht klar ist, ob dies die Spaltung des radioaktiven Jods von I-S1 beinhaltet und/oder ob das S1-Protein selbst abgebaut wird. Der größte Teil des vom Kapillarbett aufgenommenen I-S1 gelangt in das Hirnparenchym
In seltenen Fällen werden Substanzen, die die BHS zu überwinden scheinen, tatsächlich vom Kapillarbett sequestriert, was verhindert, dass sie in den Hirnparenchym-/Interstitialflüssigkeitsraum gelangen. Daher haben wir als nächstes untersucht, ob intravenös injiziertes I-S1 die Kapillarwand vollständig durchquert, um in das Hirnparenchym zu gelangen. Hierfür verwendeten wir eine modifizierte Version der „Kapillarverarmungs“-Methode, die es uns auch ermöglichte, die Menge an intravenös injiziertem I-S1 zu messen, die reversibel an der luminalen Seite des Kapillarbettes haftet. Wir fanden heraus, dass die Bindung von I-S1 an die luminale Seite im Laufe der Zeit statisch blieb, während die Menge an I-S1, die von den Hirnkapillaren zurückgehalten wurde, im Laufe der Zeit leicht anstieg. Die größte Veränderung über die Zeit zeigte sich in der Menge an I-S1, die in das Parenchym eintritt. Diese Ergebnisse zeigen, dass nach 30 Minuten mehr als 50 % des I-S1 die Kapillarwand vollständig durchquert hatten, um in die parenchymatösen und interstitiellen Flüssigkeitsräume des Gehirns zu gelangen.
WGA erhöht die I-S1-Aufnahme im Gehirn und einigen peripheren Geweben
Weizenkeim-Agglutinin (WGA) ist ein pflanzliches Lektin, das die BHS durch adsorptive Transzytose24 überwindet – ein Prozess, bei dem Proteine oder Peptide an Glykoproteine der luminalen Oberfläche von Endothelzellen binden, in Vesikel internalisiert werden und dann durch die Membran transportiert werden. Bei WGA tritt die adsorptive Transzytose auf, wenn WGA an zelloberflächliche Glykoproteine bindet, die Sialinsäure und N-Acetylglucosamin enthalten. Viele virale Proteine binden ebenfalls an Glykoproteine, die Sialinsäure und N-Acetylglucosamin enthalten, und wenn WGA zusammen mit solchen viralen Proteinen injiziert wird, erhöht es daher deren Transport über die BHS und die Aufnahme in peripheres Gewebe18. Hier fanden wir heraus, dass die Aufnahme von intravenös injiziertem I-S1 (RayBiotech oder AMSBIO) in Gehirn, Lunge, Milz und Niere erhöht war, wenn WGA in der Injektion enthalten war. Die Koinjektion von WGA erhöhte auch die Clearance von I-S1 (RayBiotech), aber nicht von I-S1 (AMSBIO), wie durch eine Abnahme von I-S1 im Blut gezeigt wurde. Die WGA-Koinjektion verringerte die Aufnahme von I-S1 (AMSBIO), aber nicht von I-S1 (RayBiotech) in der Leber, obwohl sie in einem anderen Experiment die Aufnahme von I-S1 (RayBiotech) in der Leber verringerte.
Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass I-S1 die BHS und die peripheren Gewebebetten über den Mechanismus der adsorptiven Transzytose durch Bindung an zelloberflächliche Glykoproteine, die Sialinsäure oder N-Acetylglucosamin enthalten, passiert.
Heparin blockiert die Aufnahme von I-S1 in der Leber, aber nicht im Gehirn
Einige Viren nutzen Heparansulfat auf der Zellmembran als Rezeptor25. Heparin kann die Virusaufnahme in Geweben blockieren, vermutlich durch Bindung an virale Proteine und dadurch, dass es die Bindung dieser viralen Proteine an das Heparansulfat auf den Zellmembranen blockiert. Wir stellten jedoch fest, dass mit I-S1 koinjiziertes Heparin die Aufnahme von I-S1 (RayBiotech) in Gehirn, Lunge, Milz oder Niere nicht beeinflusste und die Wirkung der WGA-Koinjektion auf die I-S1-Aufnahme in diesen Geweben nicht beeinflusste (Daten nicht gezeigt). Heparin, das zusammen mit I-S1 injiziert wurde, blockierte zwar die Aufnahme von I-S1 in der Leber, was wahrscheinlich die beobachtete verringerte Clearance von I-S1 aus dem Blut erklärte, blockierte aber nicht die Wirkung von WGA auf die I-S1-Aufnahme in der Leber. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass I-S1 heparinempfindliche Stellen nutzt, um an das Kapillarbett der Leber zu binden, aber nicht an die Kapillarbetten von Gehirn, Milz, Lunge oder Niere.
Die Aufnahme von I-S1 in das Gehirn wurde durch unmarkiertes S1 nicht blockiert
Als nächstes wurde untersucht, ob der Transport von intravenös injiziertem I-S1 (RayBiotech) in das Gehirn blockiert werden kann, indem der Injektion ein Überschuss an unmarkiertem S1-Protein (AMSBIO) beigefügt wird. Unmarkiertes S1 beeinflusste bei keiner der getesteten Dosen das Gehirn/Serum-Verhältnis für delta I-S1 (Abb. 5a), obwohl es die Aufnahme von I-S1 in der Lunge erhöhte. Dies deutet darauf hin, dass die Bindungsstelle für I-S1 im Hirngewebe nicht leicht gesättigt ist – ein Merkmal der adsorptiven Transzytose. Unmarkiertes S1 beeinflusste auch nicht das Gehirn/Serum-Verhältnis für T-Alb (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass selbst die hohe Dosis (10 μg) von S1 die BHS nicht akut störte.
ACE2 vermittelt wahrscheinlich die I-S1-Aufnahme in Gehirn und Lunge, aber nicht in anderen Geweben
Die Fähigkeit von SARS-CoV-2, in Zellen einzudringen, hängt vermutlich von der Bindung des S-Proteins an das membrangebundene Enzym (und Glykoprotein) ACE2 ab. Um festzustellen, ob ACE2 eine Rolle bei der I-S1-Aufnahme im Gehirn und in peripheren Geweben spielt, haben wir humanes ACE2 oder die ACE2-Substrate Ang II und Ghrelin zusammen mit I-S1 intravenös injiziert (RayBiotech). Dies hatte keinen Einfluss auf die Blutspiegel von intravenös injiziertem I-S1 oder T-Alb (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass diese Proteine weder das Verteilungsvolumen noch die Clearance von I-S1 oder Albumin beeinflussen. Die Koinjektion von ACE2 erhöhte die Nierenspiegel von intravenös injiziertem T-Alb: F(4,36) = 2,63, P = 0,0505; Vehikel: 119 ± 4,4 μl g-1 (n = 8 Mäuse); ACE2: 151 ± 15,6 μl g-1 (n = 8 Mäuse), P = 0,02), was möglicherweise darauf hinweist, dass ACE2 die renale Clearance von Albumin beeinflusst. Nur die Koinjektion von ACE2 erhöhte die I-S1-Aufnahme im Gehirn. Die Aufnahme in der Lunge wurde durch die Koinjektion von S1, Ghrelin oder ACE2 erhöht, aber nicht durch Angiotensin II, während die Aufnahme in Leber, Niere oder Milz durch die Koinjektion einer dieser Substanzen nicht verändert wurde (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ACE2 an der S1-Aufnahme in der Lunge und wahrscheinlich im Gehirn beteiligt ist, nicht aber an der I-S1-Aufnahme in Milz, Leber oder Niere.
Entzündung erhöht die I-S1-Aufnahme in Gehirn und Lunge
Da die SARS-CoV-2-Infektion einen Entzündungszustand induziert, haben wir als nächstes untersucht, ob ein Entzündungszustand – in diesem Fall induziert durch die Injektion von Lipopolysaccharid (LPS) – die Aufnahme von intravenös injiziertem I-S1 (RayBiotech) in Gehirn und peripheren Geweben beeinflusst. Mäuse erhielten eine Injektion von 3 mg kg-1 LPS, das aus Salmonella typhimurium (Sigma) gewonnen wurde, bei t = 0 und erneut 6 und 24 h später, und erhielten eine i.v. I-S1 plus T-Alb-Injektion 28 Stunden nach der ersten LPS-Injektion; diese LPS-Behandlung kann die BHS stören, ihre Permeabilität für Viren und virale Proteine erhöhen27,28 und den Blutspiegel vieler Zytokine erhöhen, die bei dem mit COVID-19 assoziierten Zytokinsturm erhöht sind.
Wir stellten fest, dass LPS die T-Alb-Blutspiegel nicht beeinflusste, was darauf hindeutet, dass die Entzündung bei diesen Mäusen weder eine Volumenkontraktion des Gefäßraums noch eine Undichtigkeit der peripheren Kapillarbetten hervorrief. Mäuse, die LPS erhalten hatten, wiesen höhere I-S1-Serumspiegel auf, was auf eine verminderte Clearance aus dem Blut hinweist (wahrscheinlich aufgrund der verminderten I-S1-Aufnahme in der Leber, die bei diesen Mäusen beobachtet wurde, sowie höhere T-Alb-Gehirn/Serum-Verhältnisse, die auf eine BHS-Unterbrechung hinweisen (Kontrolle: 8,52 ± 0,19 μl g-1 (n = 10); LPS: 12,2 ± 0,68 μl g-1 (n = 8), t = 5,74, P < 0,0001). Diese Mäuse hatten auch höhere I-S1-Gehirn/Serum-Verhältnisse (d. h. Verhältnisse, die nicht für I-S1 im Gefäßraum und für den I-S1-Gehirn-Eintritt aufgrund von Leckagen korrigiert wurden), was auf eine erhöhte I-S1-Passage über die BHS hinweist (Kontrolle: 12,06 ± 0. 26 μl g-1 (n = 10); LPS: 14,9 ± 0,64 μl g-1 (n = 8), t = 4,38, P = 0,0005), obwohl sich die Delta-Gehirn/Serum-Verhältnisse für I-S1 (d. h. die korrigierten Verhältnisse) nicht von den Kontrollen unterschieden (außer im Riechkolben). Das einzige periphere Gewebe, das eine erhöhte Aufnahme von I-S1 nach Erhalt von LPS zeigte, war die Lunge, wo die Aufnahme um 101 % erhöht war. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Entzündung die Toxizität von S1 für das Lungengewebe durch eine erhöhte Aufnahme erhöhen könnte. Die Ergebnisse zeigen auch, dass bei Mäusen eine Entzündung den Eintritt von intravenös injiziertem I-S1 in das Gehirn erhöhen kann, aber dies ist wahrscheinlich eher auf eine Störung der BHS zurückzuführen als auf eine Erhöhung der absorptiven Transzytose.
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I-S1 gelangt nach nasaler Verabreichung in das Gehirn und Blut von Mäusen
Einige Viren können über den Nervus olfactorius, einen Hirnnerv mit Projektionen durch die cribriforme Platte30, in das Gehirn gelangen. Andere Viren können die BHS überwinden, nachdem sie aus dem nasalen Kompartiment in den Blutkreislauf gelangt sind. Es ist unklar, ob SARS-CoV-2 in der Nase über einen dieser Wege ins Gehirn gelangen kann. Wir untersuchten daher die Fähigkeit von intranasal verabreichtem I-S1, in das Gehirn einzudringen. Nach einer Injektion einer 1-µl-Vehikel-Lösung, die I-S1 enthielt, in jeden Nasengang auf Höhe der cribriformen Platte (wo der Nervus olfactorius aus dem Schädelgewölbe austritt), wurde I-S1 in allen Gehirnregionen nachgewiesen. Die I-S1-Spiegel im gesamten Gehirn, im frontalen Kortex, im Kleinhirn, im Mittelhirn und in der Pons-Medulla waren 30 Minuten nach der Verabreichung höher als 10 Minuten danach. Die I-S1-Verteilung im Gehirn war größtenteils homogen, obwohl die Spiegel im Riechkolben und Hypothalamus 10 min nach Verabreichung höher waren als in anderen Hirnregionen und auch im Riechkolben 30 min nach Verabreichung. Die I-S1-Konzentrationen im gesamten Gehirn, ausgedrückt als Prozentsatz der verabreichten Dosis, waren nach i.v.-Injektion etwa zehnmal höher als nach intranasaler Injektion. Nach intranasaler Verabreichung von I-S1 trat Radioaktivität im Blut auf, was darauf hinweist, dass etwas I-S1 in den Blutkreislauf gelangt war (Daten nicht gezeigt). Die Fläche unter der Kurve (AUC) für I-S1 im Blut nach intranasaler Verabreichung betrug 9,42 (% inj ml-1 min-1), während die AUC für I-S1 im Blut nach i.v.-Injektion 1,430 (% inj ml-1 min-1) betrug, was darauf hindeutet, dass die Bioverfügbarkeit für die nasale Route 0,66 % betrug. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass I-S1 in das Gehirn eindringen und sich nach intranasaler Verabreichung zeitabhängig in alle Gehirnregionen verteilen kann. Allerdings ist die I-S1-Aufnahme im Gehirn über diesen Weg deutlich weniger effizient als die Aufnahme nach dem Transport über die BHS.
Auswirkungen von Geschlecht und APOE-Genotyp auf die I-S1-Aufnahme
Das männliche Geschlecht und der APOE4-Genotyp im Vergleich zum APOE3-Genotyp sind Risikofaktoren sowohl für die Erkrankung als auch für einen schlechten Verlauf von COVID-19. Daher bestimmten wir die Aufnahme von intravenös injiziertem I-S1 (RayBiotech) oder T-Alb in männlichen und weiblichen Mäusen, die humanes APOE3 oder APOE4 unter Expression des Maus-ApoE-Promotors exprimieren. APOE-Genotyp und Geschlecht hatten keinen Einfluss auf das T-Alb-Gehirn/Serum-Verhältnis. Die Zwei-Wege-ANOVA zeigte einen Effekt des Geschlechts auf die I-S1-Aufnahme im Bulbus olfactorius und in der Milz und einen Effekt des APOE-Genotyps auf die I-S1-Aufnahme in Leber, Milz und Niere. Multiple-Vergleichstests zeigten, dass im Vergleich zu den anderen drei Gruppen männliche Mäuse, die humanes APOE3 exprimieren, die schnellste I-S1-Aufnahme im Riechkolben, in der Leber und in der Niere hatten, während im Vergleich zu den anderen drei Gruppen weibliche Mäuse, die humanes APOE3 exprimieren, die schnellste I-S1-Aufnahme in der Milz hatten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine erhöhte Aufnahme von I-S1 in einigen Geweben zu dem erhöhten Risiko für COVID-19 bei Männchen im Vergleich zu Weibchen beitragen könnte, nicht aber zu dem mit dem APOE4-Genotyp verbundenen Risiko.
I-S1-Transport durch ein in vitro-Modell der BHS
Um festzustellen, ob I-S1 endothelähnliche Zellen in einem in vitro Modell der menschlichen BHS durchquert, verglichen wir den Transport von I-S1 mit dem von T-Alb über Monolayer von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC), die aus endothelähnlichen Zellen des Gehirns (iBECs) stammen und auf Transwells ausgesät wurden. Drei unabhängige Experimente zeigten, dass die Passagerate von I-S1 (RayBiotech) in luminaler-zu-abluminaler Richtung im Vergleich zu der von T-Alb nicht statistisch signifikant war. Ein Experiment zeigte, dass unmarkiertes S1 die Passage von I-S1 (RayBiotech) nicht hemmte. WGA hatte ebenfalls keinen Effekt auf den I-S1-Transport von RayBiotech. I-S1 (RayBiotech) hatte in vitro einen signifikant höheren Permeabilitätskoeffizienten als I-S1 (AMSBIO I-S1); dieser Unterschied war jedoch nach Korrektur für den T-Alb-Transport nicht signifikant. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass iBECs für I-S1 durchlässiger sein könnten als für T-Alb, aber der Unterschied ist zu gering, um mechanistische Studien mit diesem Modell zu unterstützen.
Diskussion
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass I-S1 aus zwei verschiedenen kommerziellen Quellen die BHS der Maus leicht überwinden kann, zumindest wenn es intravenös injiziert wird. I-S1 wurde von allen 11 untersuchten Hirnregionen aufgenommen. Ein solch weitverbreiteter Eintritt von I-S1 in das Gehirn könnte die vielfältigen Wirkungen von S1 und/oder SARS-CoV-2 wie Enzephalitis, Atembeschwerden und Anosmie erklären ist das SARS-CoV-2-Protein, das zunächst an Zelloberflächenrezeptoren bindet und damit die Voraussetzungen für die virale Internalisierung schafft. Für den Transport über die BHS verhalten sich die viralen Bindungsproteine oft ähnlich wie das Virus selbst. Zum Beispiel sind die Interaktionen (einschließlich Bindung und Transport) zwischen dem HIV-1-Glykoprotein gp120 und der BHS ähnlich wie die des gesamten Virus18,28. Darüber hinaus können viele, wenn nicht sogar die meisten viralen Proteine selbst biologisch hoch aktiv sein; so ist z. B. gp120 hoch toxisch. Die Spike-Proteine des Coronavirus werden oft durch Proteasen der Wirtszelle vom Virus abgespalten. Sobald sie gespalten sind, werden die Coronavirus-Spike-Untereinheiten S1 und S2 nicht mehr kovalent durch Disulfidbindungen gehalten, so dass S1 aus den Virionen ausgeschieden werden könnte. Es ist möglich, dass während einer Infektion mit SARS-CoV-2 das ausgeschiedene S1 zur Verfügung steht, um die BHS zu überwinden und Reaktionen im Gehirn selbst auszulösen, ohne dass es notwendigerweise zur Überquerung intakter Viruspartikel kommt. Daher ist die Bestimmung, ob S1 die BHS überquert, wichtig für das Verständnis, ob SARS-CoV-2 und S1 selbst Reaktionen im Gehirn auslösen könnten.
Unsere Methode zur Untersuchung der S1-Pharmakokinetik hat viele Vorteile gegenüber dem traditionelleren Ansatz zur Bestimmung der Virusaufnahme und -verteilung, der auf der Viruswiederherstellung basiert. Die radioaktive Markierung ermöglicht den Nachweis von S1 in sehr niedrigen Konzentrationen und die Quantifizierung der Aufnahmeraten für das Gehirn und andere Gewebe. Faktoren, die die Aufnahme des viralen Proteins beeinflussen könnten, können experimentell in gesunden und nicht in infizierten Tieren manipuliert werden. Die Wiederaufnahme von I-S1 aus einem Gewebe spiegelt nur Faktoren wider, die mit der Permeabilität zusammenhängen, während die Wiederaufnahme aus infizierten Mäusen auch andere Faktoren widerspiegelt, wie z. B. die Rate der Virusreplikation in diesem Gewebe.
Eine entscheidende Frage, die wir hier teilweise beantwortet haben, war: Welchen Rezeptor benutzt I-S1, um in das Gehirn und andere Gewebe einzudringen? Aufgrund der Erfahrungen mit SARS wird angenommen, dass SARS-CoV-2 an humanes ACE2 bindet, nicht aber an murines ACE2. SARS kann Wildtyp (WT)-Mäuse infizieren, führt aber nicht zu schweren Symptomen und Tod, außer bei transgenen Mäusen, die humanes ACE2 überexprimieren, obwohl dies auch einfach daran liegen könnte, dass diese transgenen Mäuse 8-12 mal mehr ACE2 exprimieren als WT-Mäuse. Die hier verwendeten Mäuse exprimierten nur murine Rezeptoren, so dass unsere Ergebnisse darauf hindeuten, dass die Annahme, dass es sich bei ACE2 um das humane Protein handeln muss, falsch ist, und zeigen, dass WT-Mäuse in Kinetikstudien von S1 und wahrscheinlich auch von SARS-CoV-2 verwendet werden können.
Wir fanden einigermaßen starke Hinweise darauf, dass murines ACE2 an der I-S1-Aufnahme im Lungengewebe beteiligt ist, da die Koinjektion von I-S1 mit löslichem ACE2 und ACE2-Substraten die Aufnahme von I-S1 erhöhte (diese vielleicht überraschende Beobachtung wird weiter unten diskutiert). Die Beweise für eine ACE2-Beteiligung an der I-S1-Aufnahme im Gehirn sind schwächer als die für die Lunge, da hier die Aufnahme durch Koinjektion mit löslichem ACE2, aber nicht durch ACE2-Substrate beeinflusst wurde. Die Feststellung, dass die I-S1-Aufnahme in Niere, Leber und Milz weder durch lösliches ACE2 noch durch ACE2-Substrate beeinflusst wurde, deutet darauf hin, dass andere Rezeptoren als oder zusätzlich zu ACE2 an der Aufnahme von I-S1 in einigen Geweben beteiligt sind.
Dass S1 und sogar SARS-CoV-2 mehr als einen Rezeptor verwenden würden, ist nicht überraschend, wenn man bedenkt, dass viele Viren mehrere Rezeptoren verwenden. Zum Beispiel nutzt HIV-1 den CD4- und den Mannose-6-Phosphat-Rezeptor, und das Tollwutvirus nutzt den Acetylcholin-Rezeptor, einen Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor und das neurale Zelladhäsionsmolekül, um in Zellen einzudringen. Zu den Rezeptoren (neben ACE2), die SARS-CoV-2 binden können oder von denen aufgrund von Modellierungen vorhergesagt wird, dass sie SARS-CoV-2 binden, gehören Basigin, Cyclophiline, Dipeptidylpeptidase-4 und GRP78.
Ein Grund dafür, dass ein Virus eine solche Vielfalt an Rezeptoren nutzen kann, ist, dass Viren weniger spezifisch binden als endogene Rezeptor-Liganden. Die Bindungsstellen für virale Proteine sind oft hochgeladene Regionen auf dem Zellmembranglykoprotein aufgrund hoher Konzentrationen von Sialinsäure, N-Acetylglucosamin oder Heparansulfat. Coronaviren binden im Allgemeinen an Glykoproteine mit hohem Sialinsäuregehalt. Pionierarbeiten zeigten, dass die Bindung von WGA an BHS-Regionen, die reich an Sialinsäure oder N-Acetylglucosamin sind, zum Transport von WGA über die BHS durch den Mechanismus der adsorptiven Transzytose führt. WGA, das zusammen mit einem schwächeren Induktor der adsorptiven Transzytose verabreicht wird, erhöht oft die BBB-Penetration des schwächeren Induktors, anstatt sie zu blockieren. In der aktuellen Studie legt die Fähigkeit von WGA, die I-S1-Aufnahme im Hirngewebe zu erhöhen, nahe, dass S1 die BHS durch adsorptive Transzytose durchquert.
Da das Spike-Protein von SARS-CoV-2 stärker geladen ist als das Spike-Protein von SARS, wurde vorgeschlagen, dass es an eine größere Anzahl von Rezeptoren binden könnte. Einige Viren binden Rezeptoren, die reich an Heparansulfat sind; die Aufnahme dieser Viren wird durch Heparin gehemmt. Wir konnten zeigen, dass die Aufnahme von I-S1 in der Leber durch Heparin gehemmt wurde, die Aufnahme im Gehirn und anderen peripheren Geweben jedoch nicht. Diese Ergebnisse zeigen, dass S1 Heparansulfat verwendet, um an die Leber zu binden, nicht aber an andere Gewebe. Wir schließen daraus, dass wahrscheinlich eine Reihe von Rezeptoren an der S1-Aufnahme beteiligt sind; welcher Rezeptor am wichtigsten ist, variiert von Gewebe zu Gewebe. Es wird wichtig sein, die membrangebundenen Glykoproteine zu identifizieren, die als Rezeptoren für SARS-CoV-2 dienen.
Es ist unklar, warum in unserer Studie die Koinjektion mit ACE2 oder ACE2-Substraten die Aufnahme von intravenös injiziertem I-S1 verstärkte und nicht hemmte, aber es gibt einige mögliche Erklärungen. Da S1 nicht an die katalytische Stelle von ACE2 bindet, kann es sein, dass die traditionelle ligandenrezeptordosisabhängige Hemmungskinetik nicht auftritt. Das ACE2, das wir zusammen mit I-S1 injiziert haben, könnte zirkulierendes Ang II gebunden haben, das normalerweise mit I-S1 um die Bindung an membrangebundenes ACE2 konkurriert hätte. Darüber hinaus ist S1 als Homotrimer an SARS-CoV-2 gebunden, aber wir untersuchten monomeres S1; es ist möglich, dass die Koinjektion von ACE2-Liganden die ACE2-Konformation so verändert hat, dass sie die Bindung des S1-Monomers erleichtert.
Zu den Risikofaktoren, sowohl an COVID-19 zu erkranken als auch einen schlechten Ausgang zu haben, gehören männliche Personen, die positiv für das ApoE4-Allel im Vergleich zum ApoE3-Allel sind, während ein Zytokinsturm ein Merkmal der schweren Erkrankung ist. Wir fanden heraus, dass der Einfluss von Geschlecht, ApoE-Genotyp und Entzündungszustand auf die I-S1-Aufnahme in den verschiedenen Geweben unterschiedlich ist. Das Geschlecht und der ApoE-Status der Mäuse hatten keinen Einfluss auf die Aufnahme von intravenös injiziertem I-S1 im gesamten Gehirn oder in der Lunge, wohl aber auf die Aufnahme im Riechkolben, der Leber, der Milz und der Niere, wobei die Aufnahme bei Männchen höher war. Dies deutet darauf hin, dass ein Teil des Risikos eines schlechten Ausgangs für Männer mit dem Grad der erhöhten Aufnahme von S1 oder SARS-CoV-2 in ihren Geweben zusammenhängen könnte. Allerdings war ApoE3, nicht ApoE4, mit höheren Aufnahmeraten von I-S1 durch den Riechkolben, die Leber, die Milz und die Niere assoziiert, was darauf hindeutet, dass das mit dem ApoE-Status assoziierte Risiko wahrscheinlich nicht auf eine erhöhte S1- oder SARS-CoV-2-Gewebeaufnahme zurückzuführen ist.
Die durch die LPS-Injektion induzierte Entzündung erhöhte die Menge an intravenös injiziertem I-S1, die in das Gehirn gelangte, aber dieser Anstieg war wahrscheinlich auf eine Unterbrechung der BHS zurückzuführen und nicht auf eine Verstärkung der adsorptiven Transzytose; tatsächlich war die Aufnahme von I-S1 nach Korrektur der BHS-Unterbrechung in einer Hirnregion, dem Riechkolben, geringer. LPS-exponierte Mäuse hatten eine höhere I-S1-Aufnahme in der Lunge, aber eine geringere Aufnahme in Milz und Leber; letzteres erklärt wahrscheinlich, warum diese Mäuse eine verminderte I-S1-Clearance aus dem Blut hatten. Bemerkenswert ist, dass diese Abnahme der Clearance aus dem Blut, die bei Mäusen in einem entzündlichen Zustand beobachtet wurde, darauf hindeutet, dass alle Gewebe höheren S1-Konzentrationen ausgesetzt sind als im nicht-entzündlichen Zustand.
Eine tödliche Infektion kann nach intranasaler Verabreichung von SARS auftreten. Es wurde postuliert, dass sich das nasale Virus in die Lunge und von dort in das Blut und das Gehirn ausbreitet, aber andere schlagen vor, dass sich SARS-CoV-2 in den Nasengängen über den Geruchsnerv in das Gehirn ausbreiten könnte, so wie es viele andere Viren tun. Obwohl unsere Ergebnisse zeigen, dass intranasal verabreichtes I-S1 in das Gehirngewebe von Mäusen eindringen kann, heben sie die BHS als den Hauptweg für den I-S1-Eintritt in das Gehirn hervor. Darüber hinaus wurde eine sehr geringe Menge (0,66 % Bioverfügbarkeit nach intranasaler Verabreichung) von I-S1 im Blut gefunden, was auf einen geringen Transfer von der Nase ins Blut schließen lässt. Unsere Studien waren jedoch darauf ausgelegt, die Fähigkeit von I-S1 zu beurteilen, über den Riechnerv in das Gehirn zu gelangen, und nicht seine Fähigkeit, über das nasale Gefäßsystem ins Blut zu gelangen. Nichtsdestotrotz sprechen unsere Ergebnisse dafür, dass andere Stellen als die Nasengänge, wie z. B. die Lunge, der Eintrittspunkt für das im Blut nachgewiesene S1 sind.
Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl die Studie zeigt, dass I-S1 die BHS in Mäusen durchquert, dies beim Menschen möglicherweise nicht der Fall ist. Aus diesem Grund haben wir In-vitro-Modelle der menschlichen BHS verwendet, die bei der Untersuchung von Mechanismen der BHS-Permeabilität nützlich sein können. Das in dieser Studie verwendete Modell wurde aus humanen iPSCs abgeleitet und entwickelt einen hirnendothelialen Zell-ähnlichen Phänotyp, der funktionelle BHS-Einstrom- und Ausstromtransporter und starke Barriereeigenschaften beinhaltet, die die Untersuchung des Transports ohne störende Effekte einer hohen Basislinien-Leckage ermöglichen. In diesem Modell konnten wir keine signifikanten Unterschiede in der Permeabilität für I-S1 im Vergleich zu T-Alb beobachten. Das offensichtliche Fehlen des I-S1-Transports über die BHS in diesem In-vitro-Modell könnte auf technische Probleme zurückzuführen sein, wie z. B. auf Blocker der I-S1-Bindung in den Puffern. Es könnte auch bedeuten, dass die iBECs die für den I-S1-Transport notwendigen Zellmembran-Glykoproteine nicht exprimieren oder dass I-S1 die menschliche BHS nicht passieren kann. Ein Hinweis auf die Gültigkeit der Verwendung von monomerem S1 als Modell für SARS-CoV-2 ist, dass S1 normalerweise als Trimer an SARS-CoV-2 gebunden ist. Das S1-Protein kann jedoch in vivo aus dem Virus ausgeschieden werden, und daher kann die Untersuchung von S1-Monomeren an sich Gültigkeit haben – obwohl es derzeit keine direkten Beweise dafür gibt, dass Spike-Proteine von SARS-CoV-2 ausgeschieden werden. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse stark darauf hin, dass das S1-Protein die murine BHS durch einen Mechanismus, der der adsorptiven Transzytose ähnelt, überwinden kann und von peripheren Geweben unabhängig von humanem ACE2 aufgenommen wird.
Methoden
Mäuse
Alle Mausstudien wurden vom lokalen Institutional Animal Care and Use Committee der Oregon Health & Sciences University und des Veterans Affairs Puget Sound Health Care System (VAPSHCS) genehmigt und in Einrichtungen durchgeführt, die von der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zugelassen sind. Männliche CD-1-Mäuse (6-10 Wochen alt) wurden von Charles River Laboratories (Hollister) erworben. Insgesamt wurden 204 CD-1-Männchen für alle Studien verwendet. Männliche und weibliche E3- und E4-Targeted Replacement (TR)-Mäuse, die wie zuvor beschrieben generiert wurden, wurden an der Oregon Health & Sciences University gezüchtet, bevor sie für die Experimente an das VAPSHCS transferiert wurden. Die E3- und E4-TR-Mäuse waren am Tag der Studie etwa 4 Monate alt. Insgesamt wurden 21 E3- und 20 E4-TR-Mäuse für alle Studien verwendet. Die Mäuse hatten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser und wurden in einem 12/12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Temperatur wurde bei 18-23 °C und die Luftfeuchtigkeit bei 40-60 % gehalten. Für alle Experimente wurden die Mäuse mit einer intraperitonealen Binjektion von 0,15-0,2 ml 40%igem Urethan betäubt, um Schmerzen und Stress zu minimieren. Die betäubten Mäuse wurden bis zum Zeitpunkt der Anwendung auf ein Heizkissen gelegt. Am Ende jeder Studie wurden die Mäuse durch Enthauptung unter Narkose euthanasiert.
Quellen und radioaktive Markierung der Proteine
Die S1-Proteine wurden von den Herstellern bereitgestellt (RayBiotech, 230-30161, Val 16-Gln 690; AMSBIO, AMS.S1N-C52H3, Val 16-Arg 685). Die Proteine wurden in PBS (pH 7,4) in einer Konzentration von 0,45-0,61 mg ml-1 aufgelöst. Die Proteine wurden in HEK293-Zelllinien produziert, hatten C-terminale His-Tags, waren rechnerisch etwa 76 kDa groß, migrierten aber aufgrund der Glykosylierung mit 100-120 kDa auf dem Gel. Nach Erhalt wurden die S1-Proteine aufgetaut und in 5-µg-Portionen aliquotiert und entweder sofort verwendet oder bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Die 5 µg des aufgetauten S1-Proteins wurden mit 1 mCi 125I (Perkin Elmer) unter Verwendung der Chloramin-T-Methode radioaktiv markiert, wie zuvor beschrieben. Das I-S1 wurde auf einer Säule aus G-10 Sephadex (GE Healthcare) gereinigt und mit PBS in Glasröhrchen eluiert, die 1% BSA in laktierter Ringerlösung (BSA-LR) enthielten. Anhand der Menge des iodierten Proteins schätzten wir, dass die spezifische Aktivität von I-S1 etwa 11 Ci g-1 oder etwa 12,5 ng pro 300.000 c.p.m. betrug. BSA (Sigma) wurde mit 99mTc (GE Healthcare) unter Verwendung der Zinntartrat-Methode markiert. T-Alb wurde auf einer Säule aus G-10 Sephadex gereinigt. Sowohl die I-S1’s als auch das T-Alb waren zu mehr als 90% säurefiltrierbar. Das Molekulargewicht der markierten Proteine wurde durch Ausführen von 200.000-600.000 c.p.m. Aktivität in 1× LDS-Puffer (Invitrogen) mit oder ohne Reduktionsmittel (Invitrogen) auf einem 4-12%igen Bis-Tris-Gel (GenScript) in MOPS-Puffer (Invitrogen) bestätigt. Das Gel wurde dann für 30 min in 10 % Essigsäure/50 % Methanol fixiert, 3× mit Wasser gewaschen und anschließend mit einem DryEase Mini-Gel Drying System (Invitrogen) getrocknet. Die getrockneten Gele wurden für 24 h auf Autoradiographie-Film belichtet und anschließend entwickelt. Die Hauptbanden von I-S1 von RayBiotech und AMSBIO migrierten bei ihren vorhergesagten Molekulargewichtsmustern, basierend auf den Herstellerangaben.
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